up
Search      menu
تولید و کشاورزی :: مقاله گندم PDF
QR code - گندم

گندم

بهينه سازي بازيافت dna از ارقام مختلف گندم

بازيافت DNA با اهداف متفاوت ژنتيکي صورت مي گيرد که يکي از اين اهداف توالي يابي DNA مي باشد. لذا ضرورت دارد که مراحل بازيافت DNA براي هر گونه گياهي بهينه شود .
به منظور بهينه سازي شرايط باز يافت DNA از ارقام مختلف گندم ، تحقيقي در آزمايشگاه ژنتيک مولکولي دانشگاه زابل صورت گرفت .DNA اين ارقام به روش دلاپورتا استخراج ، پس از تعيين غلظت نمونه ها براي تکثير قطعات DNA الگو از پرايمرهاي تصادفي و نيمه تصادفي استفاده شد . پس از الکتروفورز محصولات حاصل از PCR برروي ژل آگارز 1% ، باندهاي تکثيري که از کيفيت و وضوح خوبي برخوردار بودند انتخاب و از روي ژل جدا شده و روشهاي مختلف براي بازيافت DNA استفاده شد که مناسبترين روش بازيافت ، استفاده از PCR مجدد و ته نشين کردن DNA حاصله با اتانول بود . که در اين روش باند جدا شده از ژل پس از سانتريفيوژ لحظه اي ،به مدت 15 دقيقه در دماي 70- قرار داده شد و سپس در دماي 65 درجه حمام آب گرم قرار داده شد تا باند ذوب شود پس از آن باند ذوب شده را در تريس حل کرده و از اين محلول به عنوان ماده اصلي مجدداً براي PCR استفاده گرديد . PCR با همان شرايط PCR اوليه صورت گرفت و محصولات PCR الکتروفورز گرديده و در صورت تشکيل باند،باند حاصله را با اتانول ته نشين کرده که اين DNA ته نشين شده آماده توالي يابي ميگردد .
مقدمه:
گندم مهمترين غله ايران ودنيا است.(1)مبدأ اصلي گندم به عنوان مهمترين غله ايران وجهان در جنوب غربي آسيا بوده و10تا 15 هزار سال قبل از ميلاد مسيح از اين گياه در تغذيه انسانها استفاده مي شده است.(2)دامنه وسيع وسازگاري زياد اين گياه وهمچنين مصارف متنوع اين غله در تغذيه انسانها باعث گرديده که بعنوان مهمترين غله جهان بويژه در کشورهاي در حال توسعه وجهان سوم مطرح گرددو حدود 20درصد منابع غذايي مردم جهان را تشکيل دهد.(3) در ايران سرانه مصرف گندم براي هر فرد 150 تا200 کيلو گرم مي باشد.(7)با توجه به روند رو به افزايش جمعيت ، در کشورهاي در حال توسعه وايران واهميت اقتصادي وسياسي توليد اين گياه بايد نگاهي ويژه، به توليد واصلاح آن داشت. از طرف ديگر محدوديت ارقام سازگار به خشکي، شوري،سرماومقاوم به بيماريها وآفات وسازگار با شرايط موجود در مناطق مختلف يکي ديگر از عواملي است که توليد اين غله را در کشورهاي در حال توسعه وايران با بحران روبرو نموده است.(1)ورود مداوم ا رقام اصلاحي از خارج از کشورنيز به علت ايجاد وابستگي کشور به ديگر کشورها مقرون به صرفه نمي باشد.(2) لذانياز به اصلاح اين گياه وبهره گيري از ارقام محلي ،بومي وخويشاوندان وحشي آنها با توجه به تنوع ژنتيکي بالا ودارا بودن صفاتي چون مقاومت به بيماريها ،آفات ،خشکي ،سرما وشوري بر هيچکس پوشيده نيست.
توالي يابي DNA يکي از کاربردهاي واکنش زنجيره اي پليمراز مي باشد که بدين منظور بايستي محصولات حاصل از PCR را از ژل آگارز بازيافت نمود . (5)
براي هر گونه روش توالي يابي ، در اختيار داشتن مقدار نسبتاً زيادي از قطعه هاي يکسان DNA تک رشته اي ضروري است (6)
خلوص بالاي نمونه هاي DNA براي توالي يابي ضروري است ، تا نتايج حاصل از توالي يابي از کيفيت خوبي برخوردار باشد ، روشهاي مختلف مورد استفاده براي خالص سازي DNA بايستي بتواند از محصولات PCR ، نمونه هاي DNA خالص با غلظت مناسب بدست آورد.
براي توالي يابي قطعات DNA مربوط به فراورده هاي PCR روشهاي متعددي وجود دارند که امکان تعيين سريع توالي مورد نظر را فراهم مي آورند.
توالي يابي مستقيم فراورده هاي PCRاين امكان را فراهم مي آوردتا ويژگيهاي تواليهاي مورد نظر بدون نياز به کلون کردن فرعي يا زير کلونسازي سريعأ تعيين شوند.مزيت ديگر آن در اينست که اشتباهات ناشي از که در فراوده هاي تکثيري مشاهده مي گردند،تشخيص داده نمي شوند.چرا که اين اشتباهات بايد به ندرت در موقعيتهاي تصادفي در قطعه تکثيري بوقوع بپيوندند.
توالي يابي توده بزرگي از مولکولهاي موجود در DNAتکثير يافته امکان تشخيص اشتباهات PCRرا ازبين مي برد،مگر اينکه PCRبر روي مقادير بسيار کمي از DNAالگو انجام شود،در اينصورت اين امکان وجود دارد که اشتباهي در اوايل تکثير PCR رخ دهد و در نهايت بتوان آن را در فراورده هاي نهايي PCR تشخيص داد. بنابراين پس از توالي يابي مستقيم ،يک توالي عمومي ازمولکولهاي DNA در مخلوط واکنش PCR حاصل مي گردد.(5)
مواد وروشها:
اين تحقيق درسال 1384 در آزمايشگاه ژنتيک مولکولي وابسته به مرکز زيست پژوهشي علوم سلولي ومولکولي (بيوسنتر) دانشگاه زابل صورت گرفت.
مواد گياهي :
تعداد 12 رقم ولاين گندم از کلکسيون بذر ومرکز تحقيقات زابل تهيه شد که اين ارقام شامل:
Pethneer-2123 Hirmand,V.8187 Arvand-7,Pethneer-2123 Bolani,Hirmand ,Kalak Afghan,Star,Kavir ,Vees 3 Bows Vees Kaf 4 Bolani,Alvand,Mahdavi ,Bolani,Hamoon.
بذور در داخل گلدانهايي کشت واز برگهاي سبز براي استخراج DNA استفاده گرديد.
استخراج DNA:
استخراج DNAازنمونه هاي گياهي با روش دلاپورتا وهمکاران(Dellaporta et al 1993) انجام شد.(8)
براي تعيين کميت وکيفيت DNA ازدو روش الکتروفورز برروي ژل آگارز وبيوفتومتر استفاده شد.
واکنش زنجيره اي پليمراز:
در اين تحقيق براي تکثير قطعات DNA الگو از پرايمرهاي تصادفي ونيمه تصادفي استفاده شد، واکنش زنجيره اي پليمراز با حجم 25 ميکروليتر حاوي بافر PCR ،کلرور منيزيم ، پرايمر ، dntp ،آنزيم Taq و 30 نانوگرم از DNA ژنومي از هر نمونه انجام گرديد .
براي واکنش زنجيره اي پليمراز در دستگاه ترموسايکلر از دو نوع برنامه حرارتي استفاده گرديد .
مرحله اول واسرشت سازي ،به مدت 50 ثانيه در دماي 94 درجه سانتيگراد .
مرحله دوم اتصال ،براي پرايمر هاي تصادفي به مدت 50 ثانيه در دماي 34 درجه سانتيگراد
و براي پرايمرهاي نيمه تصادفي به مدت 50 ثانيه در دماي 50 درجه سانتيگراد .
مرحله سوم بسط ، به مدت 90 ثانيه در دماي 72 درجه سانتيگراد که اين سه مرحله 40 سيکل تکرار گرديد و درنهايت يک سيکل تکميل کننده بسط به مدت 8 دقيقه در دماي 72 درجه سانتيگراد انجام شد .
جدا سازي قطعات تکثيري:
براي جدا سازي قطعات تکثيرشده از ژل آگارز 5 1 درصد ورنگ آميزي با اتيديوم برومايد استفاده شد.
بازيافت DNA:
پس از مشاهده باندهاي تکثير شده ،باند هايي که از وضوح و کيفيت خوبي برخوردار بودند انتخاب وازروي ژل جدا شد،سپس باند جدا شده را در تيوپ قرار داده وسانتريفيوژ لحظه اي انجام شد.سپس به مدت 15 دقيقه در دماي 70- قرارداده شد وبعد از عمل منجمد شدن ،در حمام 65درجه قرار گرفت تا باند ذوب گردد.پس از آن باند ذوب شده را در تريس 10ميلي مولار حل کرده واز اين محلول به عنوان ماده اصلي مجددأ براي PCR استفاده گرديد.
قبل از انجام PCR مجدد، DNA بازيافت شده با دستگاه بيوفتومتر تعيين غلظت گرديد وسپس با همان غلظتي که براي PCR اوليه انجام شده بود براي PCR دوم نيز در نظر گرفته شدو PCRمجدد صورت گرفت.پس از آن محصول PCRبر روي ژل آگارز 5 1 درصد الکتروفورز شد وبعد از رنگ آميزي توسط اتيديوم برومايد ومشاهده باندها عمل ته نشين نمودن DNAانجام گرفت .
ته نشين کردن DNA :
ابتدا حجم محصول PCRرا اندازه گرفته وسپس 1 0 حجم آن استات سديم 3مولار(PH=5.2)ويک حجم ايزوپروپانول اضافه گرديد.سپس به مدت 10دقيقه در14000دور سانتريفيوژ گرديد.پليت حاصله با اتانول 70%چندين بار شسته شدوبعد از خشک شدن پليت در تريس 10ميلي مولارحل گرديد.(5)
اين آخرين مرحله بازيافت مي باشدوبعد از آن DNAآماده توالي يابي مي باشد.
نتايج وبحث:
براي بازيافت DNAاز روشهاي مختلفي استفاده شد که اين روشها عبارتند از:
1-بازيافت نمونه هاي DNA با فنول
در اين روش بعد از جدا کردن باند مورد نظر وذوب کردن باند ،يک حجم به آن فنول اشباع شده با TEاضافه ونمونه ها به مدت 30ثانيه ورتکس گرديد سپس به مدت 5دقيقه در 13000دور سانتريفيوژ شدند تا فازها از هم جدا شوند سپس فاز بالايي به تيوپ جديد منتقل و به نسبت 1:1 فنول اشباع شده با TEوکلروفرم اضافه ومجددأ سانتريفيوژ گرديد وسپس فاز بالايي به تيوپ جديد منتقل و يک حجم اتر به آن اضافه وورتکس لحظه اي انجام شد وسپس براي 3دقيقه در13000دور سانتريفيوژ شد.فاز بالايي به تيوپ جديد منتقل گرديد ودوباره يک حجم اتر اضافه گرديد وعمل سانتريفيوژ تکرار شد.سپس براي ته نشين کردن DNAاز اتانول استفاده شد.5 2 حجم اتانول 95% و1 0 حجم استات سديم 12 0 مولار به تيوپ اضافه واينورت گرديد .سپس در حمام آب يخ به مدت 10دقيقه قرار گرفت وبعد ازآن به مدت 15 دقيقه در دماي 4درجه سانتي گراد و12000دور سانتريفيوژ شد.فازرويي را جدا کرده وسپس اتانول 80%به ان اضافه ودر دماي اتاق براي 10-5 دقيقه قرار گرفت وسپس براي 5 دقيقه در 12000دور سانتريفيوژ گرديد. فاز بالا يي دور ريخته شد وپليت حاصله به مدت 10-5 دردماي اتاق قرار گرفت تا خشک شود.وبعد از آن در تريس 10ميلي مولار حل گرديد. (10)که در اين روش هيچ گونه پليتي حاصل نشد.
روش دوم :بازيافت DNAاز ژل آگارز (با نقطه ذوب پايين)روشي که آقاي siraisi استفاده کرده اند.در اين روش قطعه DNAاز ژل آگارز با نقطه ذوب پايين پس از رنگ آميزي با اتيديوم برمايد ومشاهده باند جدا و به تيوپ منتقل شد وسپس دو حجم TEو3 0 حجم استات سديم 3مولاربا 7 =PHبه ان اضافه گرديد ودر حمام آب گرم 65درجه گذاشته شد تا زماني که ژل ذوب گرددوبا TEمخلوط گردد.سپس يک حجم فنول اشباع شده باTEبه ان اضافه وبه مدت 30 ثانيه ورتکس گرديد.وبعد از آن به مدت 5 دقيقه در دماي 4درجه سانتي گراد ودر13000دور سانتريفيوژ گرديد.سپس فازرويي به تيوپ جديد منتقل وبعد با اتانول ته نشين گرديد.(11)مراحل ته نشين کردن در قسمت قبل توضيح داده شده است.در اين روش DNA بدست آمده از کميت وکيفيت مناسبي برخوردار نبود.
روش سوم که توسط سلوکي وهمکاران انجام شد.(13)در اين روش پس از جدا کردن باند مورد نظر ازژل وانتقال به تيوپ به مدت 2دقيقه در 8000دور سانتريفيوژ گرديد وسپس 400ميکروليتر آب مقطربه آن اضافه ودر حمام آب گرم 65درجه سانتي گراد به مدت 10 دقيقه قرار گرفت وسپس 500ميکروليتر فنول به آن اضافه و30ثانيه ورتکس گرديد.پس از آن به مدت 10 دقيقه در 8000دور سانتريفيوژ شد.فاز رويي را بر داشته وبه تيوپي که حاوي 250ميکروليتر فنول و250کلروفرم بود منتقل شد.نمونه ها به مدت 30 ثانيه ورتکس وسپس به مدت 5دقيقه در 8000دور سانتريفيوژ گرديد.فاز رويي به ميکرو تيوپ منتقل و500ميکروليتر کلروفرم به آن اضافه شد ومانند مرحله قبل ورتکس وسانتريفيوژ گرديد.مجددأ فاز رويي به تيوپ جديد منتقل وبراي ته نشين کردن DNA از 1ميکرو ليتر استات آمونيوم (5 7 مولار)و5 2 حجم اتانول استفاده شد وسپس در 20- درجه سانتي گراد براي 24ساعت قرار گرفت.ودر روز بعد نمونه ها به مدت 30دقيقه در 8000دور سانتريفيوژ گرديد. پليت حاصله پس از خشک شدن درتريس 10ميلي مولار حل گرديد.در اين روش نيز DNAحاصله از کميت وکيفيت مناسبي برخوردار نبود.
روش چهارم که استفاده از PCRمجدد بود درقسمت ماد وروشها توضيح داده شده است . اين روش بهترين ومناسبترين روش براي بازيافت DNAبود زيرا که DNA حاصله
از کيفيت وکميت مناسبي بر خوردار بودو همين روش به عنوان روش اصلي براي بازيافت انتخاب شد.

گندم گذشته از جنبه تجارتي مهم آن در دنيا، سلاحي کارآمد در مناسبات سياسي و جهاني است که روز به روز بر اهميت کاربردي آن افزوده مي شود. با اينکه جمعيت اي ...

گندم گذشته از جنبه تجارتي مهم آن در دنيا، سلاحي کارآمد در مناسبات سياسي و جهاني است که روز به روز بر اهميت کاربردي آن افزوده مي شود. با اينکه جمعيت اي ...

● گندم ▪ کشت گندم در ابتداي هر کشتي بايد زمين را آماده نماييم . نکته مهم در آماده سازي بستر بذر با توجه به اينکه گندم به نشست خاک در بعد از رويش فوق ا ...

کمبود پس مانده هاي گياهي،کلوخه و زبر خاک بر سطح خاک مي تواند يک تهديد فرسايش بادي خطرناک را بوجود آورد و مطرح سازد. سيستم خاکورزي حفاظتي در پاسيفيک نو ...

● معرفي گونه کنترل گر بيولوژيک گونه خانواده راسته بلدرچين قرقاول ماکيان سانان Coturnix coturnix Phasianidae Galliformes بلدرچين معمولي يک ...

عمده ترين بخش هزينه هاي يك واحد مرغداري را خوراك تشكيل مي دهد كه حدود ۷۰ درصد كل هزينه هاي توليد را شامل مي شود، يكي از راه هاي كاهش اين هزينه ها يافت ...

به منظور تعيين حد بحراني پتاسيم براي محصول گندم ، در نواحي عمده کشت اين محصول در يک منطقه و در فاميل هاي غالب خاک ، تعداد چندين مزرعه انتخاب مي شود . ...

رشد قارچ هاي عالم بوته ميري گندم با روش كشات بذر بر روي پشته هاي بلند به دليل عدم حالت غرقابي كمتر مي شود. روش هاي كشت گندم به وسعت و شيب زمين، مقدار ...

دانلود نسخه PDF - گندم