up
Search      menu
علم و تکنولوژی :: مقاله آگار PDF
QR code - آگار

آگار

تکنيکهاي تهيه و توليد کشت آگار

● مقدمه
هوايي که از آن تنفس ميکنيم مملو از موجودات بسيار ريز است که با باد به حرکت درميآيند. قارچها، باکتريها، ويروسها و گياهان براي انتقال گردههاي خود به مناطق ديگر از باد کمک ميگيرند. در صورت عدم رعايت نکات بهداشتي، اين ذرات ميتوانند چه در تهيه کشت خالص و چه در فرآيند توليد قارچ خوراکي خلل وارد نمايند.
به طور کلي منابع اصلي آلاينده محيط کشت عبارتند از
۱) محيط اطراف
۲) ظروف کشت
۳) ادوات و ابزار کشت
۴) پرورش دهنده و لباس وي
۵) هاگها يا ميسليوم قارچ خوراکي
قارچها و تمامي موجودات زنده نسبت به مواد غذايي، رقابت تنگاتنگ و دائمي با يکديگر دارند. هدف از ايجاد يک محيط استريل، حذف يا کاهش اين گونه رقابت و در نهايت فراهم ساختن شرايط مناسب براي تکثير قارچ خوراکي ميباشد. اولين مرحله قبل از تهيه کشت خالص، احداث اطاقک تلقيح يا آزمايشگاه استريل است.
● طراحي و احداث آزمايشگاه استريل
علت عمده شکست بيشتر پرورشدهندگان قارچ، عدم صرف وقت کافي به منظور احداث آزمايشگاه استريل است. کاري که چندان هم وقت و انرژي نميبرد، بلکه فقط يک و نيم روز کافي است تا يک انباري کوچک يا يک آبدارخانه را به يک اطاقک تلقيح مفيد تبديل نمود.
براي شروع تمام قاليچهها، پتوها، پردهها و ديگر مواد پارچهاي را که پناهگاه خوبي براي گرد و غبار و هاگهاي مضر مي باشند از محل دور کرده و تمامي ديوارها و سقف را با يک ماده ضد عفوني کننده کاملاً تميز نمائيد. اطاق را با يک رنگ روغني براق يا اپوکسي بهداشتي رنگ زده تا شستشوهاي بعدي راحتتر گردد. پنجرهها يا هر منبع ورودي هوا را با يک پوشش پلاستيکي مناسب بپوشانيد. محل ورودي اطاق را با پلاستيک يا هر ماده ديگر بصورت يک محفظه انتظار درآورده تا مانع جريان مستقيم هوا بدرون اطاق گردد و طراحي اين محفظه بايد به گونهاي باشد که هنگام ورود به آن؛ درب آزمايشگاه بسته باشد.
تجهيزات ذيل در هر آزمايشگاه ضروري است:
۱) صندلي و ميز محکم با سطح کاملاً صاف
۲) چراغ الکلي، چراغ بنسن يا يک شعله معمولي گاز بوتان براي توليد حرارت
۳)بطري اسپري حاوي محلول سفيد کننده ۱۰ درصد
۴) تعدادي پتري ديش استريل و لوله آزمايش
۵) تعدادي برچسب ، يک دفتر و خودکار
۶) يک چاقوي آگار و حلقه تلقيح
۷) يک دستگاه اتوکلاو يا زودپز معمولي (بخار تحت فشار)
۸) pH سنج يا کاغذ تورنسل معمولي
۹) الکل ۹۶ درصد و ديگر مواد ضد عفوني همچون وايتکس، فرمالين…
۱۰) قفسه براي ظروف کشت، جالولهاي و…
تمامي اين اجزاء بايستي درون آزمايشگاه بماند و در صورت خروج يکي از آنها به بيرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمايشگاه بايد از تميز بودن آن، مطمئن شد.
به طور کلي براي طراحي يک آزمايشگاه بايد علاوه بر تجهيزات و وسايل گفته شده اصول زير نيز درنظر گرفته شود.
اطاق تهيه محيط کشت که داراي تجهيزات کامل و قفسههاي متعدد است (۳۵ درصد مساحت کل)
اطاقک شيشهاي استريل (محفظه تلقيح)(۱۵ درصد مساحت کل)
اتاق کشت (۴۰ درصد مساحت کل) الباقي مساحت براي نگهداري وسايل، اتوکلاو، ترازوها، يخچال و انبار ميسليوم و اسپان مادري (حدوداً ۱۰ درصد)
با روش سادهاي ميتوان آزمايشگاه يا محيطي نيمه استريل بسته به حجم استفاده و دفعات کاري ايجاد نمود. درصد پاکي لازم براي اطاق استريل تابع مقدار هاگ محيط بيرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلايندههاي هوا تا حد زيادي کاهش يافته، حال آن که در طول تابستان و بهار اين مقدار بسيار زياد ميباشد. بنابراين لازم است در طي اين دو فصل توجه کافي به استريل بودن محيط آزمايشگاه مبذول گردد. نکته مهم ديگر اين که، تمامي ظروف و بطريهاي شيشهاي آلوده را بايد به طريقي از بين برد تا ضريب آلودگي محيط آزمايشگاه به حداقل برسد.بعد از احداث اطاق استريل بايد يک سري اصول و نکات بهداشتي را کاملاً رعايت نمود. به اين صورت که اطاق استريل را بايد با يک محلول سفيدکننده (آب ژاول) کاملاً تميز نمود؛ کف را طي کشيده و در پايان هواي اطاق را با يک محلول سفيد کننده ۱۰ درصد و با استفاده از يک سمپاشي پشتي يا اسپري ضدعفوني نمائيم. حداقل تا ۱۵ دقيقه بعد از محلول پاشي نبايد وارد اطاق شد. در هر مرحله از تلقيح و کشت اين عمليات بايد تکرار شود، چرا که همواره پيشگيري آسانتر و بهتر از درمان است.
پيش از ادامه بحث، ذکر چند نکته ضروري است. استريل نمودن و استريل نگاه داشتن محيط مستلزم توجه زياد همراه با کمک و ياري مداوم ديگران است. اين امر وقتگير بوده و نبايد سرسري و مقطعي انجام گيرد. هرگز يک چراغ الکلي يا شعله گاز را درون اطاق يا محفظه تلقيح روشن نگذاريد، چرا که در يک محيط بسته اکسيژن هوا به زودي تمام ميشود.
بعضي از پرورشدهندگان، بيش از نياز لازم بهداشتي با آلودگي مقابله مينمايند. بدين ترتيب اين افراد آزمايشگاه و در نهايت سلامتي خود را با مصرف وسواسي و افراطي قارچکشها، باکتريکشها و ضدعفوني کنندههاي شيميائي جهشزاي خطرناک به خطر مياندازند. به طور مثال ميتوان به عوارضي همچون تنگي نفس، بيحسيهاي شديد همراه با تشنجهاي مداوم که گاه تا چندين روز نيز به درازا ميانجامد که بر اثر کار طولاني مدت افراد، بلافاصله در اطاقهائي که مدت چنداني (کمتر از ۱۵ دقيقه) از سمپاشي آنها بالاخص با سموم فنلي نگذشته اشاره کرد و يا از بين موارد متعدد ديگر، ابتلاء به سرطان پوست بواسطه تماس طولاني (چند سال) و مستقيم پوست (بدون پوشش ايمني) با اشعه ماوراي بنفش (uv) در حين استريل کردن نمونهها داخل محفظه شيشهاي درون اطاق تلقيح اشاره نمود.
چنانچه عليرغم تلاش فراوان در جهت استريل نمودن محيط آلودگي باز هم در محيط باقي بماند در آن صورت ميتوان از راهکارهاي ذيل استفاده نمود.
۱) بخوردادن روغن استريلکننده مانند ترياتيلن گلايکول باگرمکنفتيلهاي درفضاي اطاق که ابري از قطرات بسيار ريز و نسبتاً سنگين در هوا ايجاد شده که ضمن پائين آمدن ذرات آلاينده معلق در هوا را جذب کرده و از بين ميبرند. ذرات اين روغن نسبتاً ريز و فرار بوده و هيچ گونه لايه قابل مشاهدهاي در فضا ايجاد نمينمايد. اين روش ارزان و آسان ميباشد.
۲) احداث نوعي محفظه شيشهاي کاملاً مسدود و نيمه استريل براي نقل و انتقال و کارهاي کشت بافت که ميتوان آنها را از چوب و پنجرهاي کوچک براي نگاه کردن درون آن ساخت که در يک طرف آن دو سوراخ لاستيکي مخصوص تعبيه مينمايند تا هنگام کار، فرد بتواند دستان خود را داخل محفظه کرده و در صورت عدم استفاده، ورودي سوراخها با لفافهاي پوشيده ميشود. مزيت عمده اين محفظه ارزان، بودن استريل کردن آسان محيط داخل آن و عدم جريان مستقيم هوا به درون آن در ضمن کار ميباشد.
۳) استفاده از صافيهاي بسيار ريز که قطر چشمههاي آن ۳ ۰-۱ ۰ ميکرون بوده و از قطر هاگهاي مضر بعضي قارچها و حتي از باکتريها نيز کوچکتر است. از اين صافيها در سامانههاي مخصوصي بنام هود تهويه ملايم استفاده مينمايند. در برخي از آزمايشگاههاي پيشرفته تمام استريل، درون ديوارها يا سقف نيز از اين نوع صافيها استفاده شده و هواي ورودي اطاق با عبور از ميان آنها تصفيه ميشود.
براي کسب اطلاعات بيشتر به ضميمه چهارم مراجعه شود
آلودگي، ممکن است در يک محل کم و در جاي ديگر زياد باشد و يا در يک مرحله از پرورش طغيان نمايد يا اين که عليرغم چند سال فعاليت، اثري از آن ديده نشود. از طرفي بايد توجه داشت که نوع آلودگي، در مراحل و مکانهاي مختلف يکسان است، اما شدت و ضعف آن بسته به يک سري عوامل مختلف داخلي يا محيطي متفاوت است که با اعمال يک سري تمهيدات و اصول بهداشتي تا حدي ميتوان آن را کنترل نمود.
● ميزان هاگ آلاينده درون آزمايشگاه
▪ آماده کردن محيط کشت
پس از تکميل آزمايشگاه نوبت به تهيه محيط کشت مغذي آگار ميرسد. آگار، محصولي است که از نوعي جلبک دريايي بدست آمده و براي سفت کردن محيط کشت بکار ميرود و از نظر ظاهري بسيار شبيه ژلاتين است اما از نظر کارکرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمينه توليد محيط کشت آگار غني شده که مناسب قارچهاي خوراکي باشد، فرمولهاي متعددي وجود دارد که از اين ميان ميتوان به فرمولهاي استاندارد PDA وMEA همراه با مکمل خميرمايه اشاره نمود. در بسياري از مجلات قارچ شناسي، فهرستي از انواع محيطهاي کشت آگار حاوي پپتن و نئوپپتن (دو منبع سرشار از پروتئين مورد نياز ميسليوم) ارائه شده است. محيط کشتي که مؤلفان توصيه مينمايند، مخلوطي از دانههاي جوشانده شده گندم يا چاودار غني شده با شيره مالت است. براي افزايش رشد ميتوان به محيط کشت زايلوز و ۱- آرابينوز (از قندهاي پنج کربنه پنتوزي متبلور) اضافه کرد. از جمله مواد لازم ديگر براي محيط کشت ميتوان کلسيم، بيوتين، تيامين، اسيدهاي آمينه اسپاراژين، آلانين و گلايزين را نام برد.
آنچه در ادامهميبينيد سه نوع فرمول مغذي آگار است که هر کدام از آنها براي رشد ميسليومهاي انواع مختلف قارچ خوراکي همچون دکمهاي، صدفي، شيتاکه، استروفاريا، چيني، پانالوس و سيلوسب استفاده ميشود که از بين آنها؛ ۲ محيط PDY و MPG مورد توجه مؤلفان اين کتاب ميباشند. توصيه ميشود براي افزايش رشد ميسليومها به هر محيط، مقداري پودر چاودار و يا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر يک از فرمولهاي زير ترکيبات آن را بصورت خشک با هم مخلوط کرده، درون يک فلاسک ريخته و درنهايت با افزودن آب، حجم مخلوط را به يک ليتر برسانيد.
الف) آگار PDY (مخمر دکستروز سيبزميني)
عصاره صاف شده ۳۰۰ گرم خلال سيبزميني که در يک ليتر آب تا يک ساعت جوشيده باشد.
۱۰ گرم قند (گلوکز راست گرد) (قند دکستروز)
۲ گرم مخمر (اختياري)
- ۲۰ گرم آگار
ب) آگار MPG (مخلوط بذر پپتين مالت)
۲۰ گرم مالت عسلي رنگ
۵ گرم پودر بذر چاودار
۵ گرم پپتين يا نئوپپتن
۲ گرم مخمر (اختياري)
۲۰ گرم آگار
ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)
۲۰ گرم مالت عسلي رنگ
۲ گرم مخمر
۲۰ گرم آگار
● در تهيه محيط کشت، رعايت نکات زير ضروري است
۱) pH محيط کشت: گونههاي متفاوت قارچ براي رشد و نمو در محيط کشت، pH خاص خود را ميطلبند. بطوري که pH مطلوب براي گونههاي سيلوب ۷-۶ ميباشد؛ در حالي که اين مقدار براي نوع دکمهاي ۷-۵ ۶ ميباشد. اکثر گونهها، نسبتاً مقاوم بوده و بخوبي در دامنه ۵ ۷ –۵ ۵ رشد مينمايند. pH کمتر از ۵ ۴ و بالاتر از ۷ باعث توقف رشد و نمو (هاگها و ميسليومها) ميگردد و چنانچه pH محيط خيلي پائين باشد. محيط کشت رقيق ميشود و بايد محيط تازه با pH مطلوب آماده شود. pH ، بعد از اتوکلاو کردن تا ۴ ۰ واحد کاهش مييابد.
چنانچه در حين تهيه محيط کشت، pH خيلي پائين يا بالا رود، ميتوان بترتيب آن را با Naoh يا Hcl (۱ تا ۱ ۰ مولار) رقيق، تعديل کرده سپس محيط کشت را کاملاً هم زده و سپس pH آن را با يک pH سنج يا کاغذ تورنسل معمولي ميسنجيم ( pH يک مول Hcl ، صفر؛ يک مول Naoh =۱۲ و يک مول آب مقطر= ۷ است).
۲)ضدعفوني محيط کشت: اين کار معمولاً به دو روش صورت ميگيرد.
الف) با مواد شيميائي: مانند الکل ۷۰درصد؛ هيپوکلريت سديم (وايتکس) ۱درصد و بالاخص آنتيبيوتيکها. در هر صورت سادهترين راه، استفاده از مواد گياهي غير آلوده است. جهت کنترل باکتريها در محيط کشت، ۱ ۰ گرم از محلول سولفات جنتامايسين ۸۰-۶۰درصد را قبل از عمل اتوکلاو کردن بايد به هر ليتر از اين محيطها اضافه نمود. همچنين ميتوان از نوع ديگر آنتيبيوتيک بنام استرپتومايسين بعد از استريل کردن محيط کشت استفاده کرد. در مجموع بايد از آنتيبيوتيکها بصورت موقتي و به مقدار بسيار اندک بهره جست چون غلظت بالاي آنها، مانع رشد و نمو بعضي گونهها و از طرف ديگر ايجاد مقاومت در باکتريها ميشود.
ب) با بخار: بعد از اختلاط کامل ترکيبات محيط کشت و در صورت باقي ماندن اثرات باکتري بعد از ضدعفونيِ شيميائي (آنتيبيوتيکها) ميتوان براي رفع هر گونه آلودگي با بخار تحت فشار، محيط کشت را استريل و يا به اصطلاح اتوکلاو نمود. استريل کردن صحيح، بستگي به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استريل دارد. در شرايط عادي ميتوان محيط کشت آماده را داخل ارلن پيرکس (به علت دهانه تنگ آن ميزان تهويه، خشک شدن و ضريب آلودگي کاهش مييابد) ريخته درب آن را با يک فويل آلومينيومي پوشاند. دقت کنيد که حجم آگار درون ارلن نبايد از تا حجم کل ظرف بيشتر شود.
ظرف کشت را داخل اتوکلاو يا زودپز معمولي قرار داده و ته زودپز را يک سانتيمتر آب مقطر بريزيد تا بخار لازم تأمين شود. طبق دستورالعمل شرکت سازنده، درب زودپز را کاملاً بسته آن را حرارت دهيد تا بخار فراوان توليد نمايد. قبل از بستن سوپاپ اطمينان بخار، بگذاريد تا بخار آن به مدت ۴ تا ۵ دقيقه خارج شود. به آرامي فشار را به ۱۵ پوند رسانده و ۳۰ دقيقه در همين فشار نگهداريد. توجه کنيد دماي ظرف از ۱۲۱ درجه سانتي گراد فراتر نرود، چه در غير اين صورت قند موجود در محيط کشت، سوخته و به اصطلاح کارامل ميشود که در نتيجه آن؛ رشد ميسليوم متوقف شده، يکسري جهشهاي ناخواسته ژنتيکي پديدار ميشود. از طرفي اتوکلاو کردن بيش از ۳۰ دقيقه باعث تهنشين شدن املاح مفيد (بخصوص k+ ) و تجزيه آگار ميشود. هم چنين بايد ظروف خالي شيشهاي و کاغذها را بطور جداگانه به مدت ۳۰ دقيقه در دماي ۱۳۰ سانتيگراد (بصورت خشک) استريل نمود.
نکته حائز اهميت ديگر در مورد اتوکلاو کردن، اين که زمان لازم براي اين عمل بسته به ارتفاع از سطح دريا، متفاوت است. طبق قانون بويل ماريوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقيمي با يکديگر دارند. فشار هوا را معمولاً نسبت به سطح استاندارد دريا محاسبه نموده و هر چه از سطح دريا بالاتر ميرويم فشار هوا کمتر ميشود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دريا، بايد فشار اتوکلاو يا زودپز را افزايش دهيم تا خللي در عمل استريليزاسيون وارد نشود. ذيلاً نسبتهاي بين پارامترهاي دما، فشار هوا، و تغييرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذيل ميبينيد. بعنوان مثال در ارتفاع حدوداً ۱۵۰۰ متري از سطح دريا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دريا تقريباً ۵ ۴ -۵ درجه سانتيگراد کاهش مييابد (C&#۷۳۰;۹۵) و از طرفي در اين ارتفاع؛ فشار هوا ۵ پوند يا تقريباً ۴ ۰ اتمسفر نسبت به سطح دريا افزايش مييابد (۴ ۱ اتمسفر) در نتيجه با توجه با اين که نبايد دماي داخل اتوکلاو را (به سبب بروز تغييرات شيميائي مواد داخل آن) افزايش دهيم، بناچار مجبوريم، فشار را به ميزان ۴ ۰ آتمسفر (۵ پوند) بالا ببريم تا جبران ۵ اختلاف دما را در اين ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوکلاو بنمايد.توجه کنيد استريليزاسيون در فشار ۰۵ ۱ kg cm۲ به مدت يک ساعت داراي نتايج مشابهي با استريليزاسيون در فشار kg cm۲۲ به مدت ۳۰ دقيقه (يعني دوبرابر کردن فشار و نصف کردن مدت زمان) دارد؛ منتها مسأله مهم در اين جا اين است که اکثر زودپزها تحمل اين فشار را ندارند که بايد حتماً قبل از استفاده به برچسب کنترل کيفي روي هر زودپز توجه شود.
بعد از اتمام استريل کردن؛ زودپز را در آزمايشگاه يا يک اطاق نيمه استريل قرار داده، اجازه دهيد تا قبل از باز کردن درب آن، فشار به يک پوند (۰۷ ۰kg cm۲) کاهش يابد. سپس درب آن را باز نمائيد و اقدام به ريختن آگار در پتري ديشها نمائيد. بايد دانست با هر ليتر از محلول آگار بدست آمده ميتوان ۳۰ پتري ديش ۱۵×۱۰۰ ميليمتر را پر نمود. چنانچه با محدوديت فضاي ميزکار مواجه هستيد، ميتوانيد پتري ديشها را پس از پر نمودن يک به يک روي هم بگذاريد اما درغير اين صورت ميتوانيد هر يک از پتري ديشها را در کنار هم قرار دهيد و دامنه کار خود را توسعه دهيد
پيش از پر نمودن پتري ديشها، محلول کشت را به شدت تکان دهيد تا محتويات آن خوب پخش شده مخلوطي همگن بدست آيد. سپس بگذاريد تا آگار خنک شده و يکنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتري ديشها نمائيد تا بدين وسيله از تعريق جدار داخلي ظروف که از ريختن محلول آگار گرم ناشي ميشود، جلوگيري شود.
حال، اين محلول آماده کشت هاگ يا بافت زنده ميباشد که در ادامه روش آنرا خواهيم ديد.
● کشت هاگ
کشت خالص به منظور تهيه اسپان مورد نياز براي تکثير قارچ خوراکي را به دو روش ميتوان تهيه نمود. کشت هاگ، که به نوعي ميتوان آن را تکثير جنسي ناميد و داراي تفريق صفات و تنوع بالاي نتاج حاصله از نظر کيفيت و کميت محصول ميباشد. از اين روش بيشتر براي تهيه بذر قارچ استفاده ميشود. روش دوم کشت بافت زنده يا به اصطلاح تکثير غيرجنسي و يا کلونينگ ميباشد. اين روش به علت شباهت بالاي نتاج توليدي با والدين؛ بيشتر در تکثير قارچهائي که از نظر کيفيت و کميت محصول در حد مطلوبي هستند استفاده ميشود.
پرورش دهندگان قارچ، کشت هاگ را بدليل راحتي اجرا و ماندگاري بالاي هاگها حتي تا ماهها بعد از تجزيه کلاهکها ترجيح ميدهند. اما ماندگاري کلاهکها يا بافت زنده بسيار کم است (۱ تا ۲ روز) و بايد بلافاصله بعد از چيدن بافت، اقدام به کشت نمود.
● گرفتن نقش هاگ
مرحله اول در کشت هاگ؛ جمعآوري مقداري هاگ (نقش اسپور) از قارچهاي سالم و مناسب ميباشد. بدين منظور کلاهک سالم، تازه و کاملاً تميزي را از ساقه جدا نموده و بطور واژگون روي يک کاغذ سفيد يا سطح شيشهاي تميز (اسلايد ميکروسکوپ) يک تا دو ساعت ميگذاريم. چنانچه کلاهک موردنظر خشک باشد، جهت رهاسازي آسانتر هاگ يکي دو قطره آب مقطر به آن زده و براي جلوگيري از کاهش تبخير و جريان هواي مستقيم، يک بشر بر روي آن ميگذاريم. پس از چند ساعت که هاگها، کاملاً رها شد و نقش تيغهها روي کاغذ افتاد؛ کاغذ هاگها را بريده از وسط تا ميزنيم و دريک ظرف کاملاً در بسته گذاشته وروي آن را بر چسبي حاوي زمان جمعآوري؛ گونه قارچ و شماره جمعآوري ميزنيم. در صورت جمعآوري هاگها روي لامل ميکروسکوپ، کافيست هاگها را ما بين دو لامل قرار داده دور تا دور لبه اين دو لامل را با نوار چسب بچسبانيم تا از نفوذ هاگهاي آلاينده، ايمن شود. در صورتي که در جمعآوري و نگهداري هاگها دقت کافي نشود، محيط کشت هاگ آلوده شده و امکان به دست آوردن يک کشت خالص کاهش مييابد.

● مقدمه هوايي که از آن تنفس مي کنيم مملو از موجودات بسيار ريز است که با باد به حرکت درمي آيند. قارچ ها، باکتريها، ويروسها و گياهان براي انتقال گرده ها ...

الکتروفورز از شناخته شده ترين روش هاي آزمايشگاهي براي جداسازي بيومولکول ها است. اين روش در سال ۱۸۰۷ توسط Reuss کشف شد. او مشاهده کرد که ذرات خاک رس تح ...

صمغ ها و آلکالوئيد ها صمغ ها گروه بزرگي از پلي ساکاريد هايي هستند که بوسيله توانايي شان در توليد محصولاتي با ويسکوزيته بالا در غلظت هاي پايين مشخص مي ...

دانلود نسخه PDF - آگار